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过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒阐明书
点击次数:136 公布工夫:2022-11-22

过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒阐明书

微量法


留意:正式测定之前选择 2-3 个预期差别大的样本做展望定。

规格:100T/96S 产品内容:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保管; 试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保管;

试剂二:液体 0.2mL×1 瓶,4℃保管;用时参加 3mL 试剂一,现配现用,可 4℃保管一周; 试剂三:液体 3 mL×1 瓶,4℃保管。

产品阐明:

###普遍存在于植物、动物、微生物中,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消弭过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 在有过氧化氢存在的状况下,能使愈创木酚产生氧化,天生茶褐色物质,该物质在 470nm 有最大光吸取。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

操纵步调:

一、粗酶液提取:

1、细菌、细胞或构造样品的制备

搜集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;依照每 500 万细菌或细胞参加 1mL 提取液,超声波破裂细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,距离 10s,反复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

称取约 0.1g 构造,参加 1mL 提取液举行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:间接检测。二、测定步调:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调治波长至 470nm,蒸馏水调零。

2、 测定前将试剂一、二和三在 37℃(哺乳植物)或 25℃(别的物种)安排 10min 以上。

3、 样本测定表

试剂称号(µL)

测定管

试剂一

120

试剂二

30

试剂三

30

蒸馏水

60

样本

5





在 EP 管中按次序参加上述试剂,立刻混匀并计时,立刻取 200µL 转移至微量玻璃比色皿或 96

孔板中,记载 470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。盘算∆A=A2-A1。

POD 活性盘算:

用微量玻璃比色皿测定的盘算公式如下

1、按血清(浆)体积盘算

单元界说:每 mL 血清(浆)在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.01 界说为一个酶生机单元。

POD(U/mL)=∆A÷0.01×V 反总÷V 样÷T =4900×∆A

2、按样本卵白浓度盘算

单元界说:每 mg 构造卵白在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.01 界说为一个酶生机单元。

POD(U/mg prot)=∆A÷0.01×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T =4900×∆A÷Cpr 3、按样本鲜重盘算

单元界说:每 g 构造在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.01 界说为一个酶生机单元。

POD(U/g 鲜重)=∆A÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T =4900×∆A÷W 4、按细菌或细胞数目盘算

单元界说:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.01 界说为一个酶生机单元。

POD(U/104 cell)=∆A÷0.01×V 反总÷(500÷V 样总×V 样)÷T =9.8×∆A

用 96 孔板测定的盘算公式如下

1、按血清(浆)体积盘算

单元界说:每 mL 血清(浆)在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.005 界说为一个酶生机单元。

POD(U/mL)=∆A÷0.005×V 反总÷V 样÷T =9800×∆A

2、按样本卵白浓度盘算

单元界说:每 mg 构造卵白在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.005 界说为一个酶生机单元。

POD(U/mg prot)=∆A÷0.005×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T =9800×∆A÷Cpr 3、按样本鲜重盘算

单元界说:每 g 构造在每 mL 反响系统中每分钟 A470 变革 0.005 界说为一个酶生机单元。

POD(U/g 鲜重)=∆A÷0.005×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T =9800×∆A÷W 4、按细菌或细胞数目盘算

单元界说:每 1 万个细菌或细胞在每mL 反响系统中每分钟A470 变革 0.005 界说为一个酶生机单元。

POD(U/104 cell)=∆A÷0.005×V 反总÷(500÷V 样总×V 样)÷T =19.6×∆A

V 反总:反响系统总体积,0.245mL;V 样:参加样本体积,0.005mL;V 样总:参加提取液体积,1 mL;T:反响工夫,1 min;Cpr:样本卵白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

留意事变:

1、 如一次测定的样本数目较多,可将试剂一、二、三和蒸馏水依照比例混淆,在 37℃(哺乳植物) 或

25℃(别的物种)安排 10min,测定时参加 240µL 即可。

2、 样本测定值假如小于 0.005,可将反响工夫延伸到 3-5 分钟,盘算时除以反响工夫即可;假如高于 0.5,可将样本用提取液举行浓缩。盘算时乘以响应的浓缩倍数即可。




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